Code produit : BMC-12

La pcr quantitative : maîtriser la technologie

  • Vous connaîtrez l'ensemble des paramètres à maîtriser pour réaliser une quantification.
  • Vous saurez trouver la stratégie adéquate pour améliorer le rendement de vos PCR quantitatives.
  • Vous saurez designer vos amorces.
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  • Evaluation
Objectifs pédagogiques

Présenter tous les paramètres des cinétiques d’amplification et de dissociation et de souligner leur importance dans les calculs de quantification.
Souligner l’impact du choix des amorces sur les résultats.
Rendre le design des amorces accessible.
Trouver une bonne stratégie pour gagner beaucoup de temps et d'efficacité.
Comprendre l’importance de la rigueur extrême nécessaire dans cette technique à chaque étape afin d'obtenir reproductibilité et fiabilité des résultats.

Programme

PCR quantitative : aspect théorique

  • Analyse de la courbe de dissociation (Melting Curve Analysis)
    • Définition du TM
    • Spécificité de séquence et TM de l’amplicon
    • Contaminations
    • Dimères d’amorces
    • Qualité et validation de la PCR
  • Étude de la cinétique d’amplification
    • Identification et propriétés mathématiques de la phase exponentielle
    • Bruit de fond des fluorophores
    • Seuil de détection (Cp/Ct/Cq)
  • Efficacité de la PCR
    • Définition et utilité E=10 -1/pente
    • Calcul de l’efficacité par régression linéaire d’une gamme de dilution
    • Validation des amorces : dynamique, linéarité et limite de détection
    • Standardisation et validation des manipulations de PCRQ (intra et inter-run)
    • Les contrôles indispensables
  • Quantification par PCR en temps réel
    • ARN et ADN génomique
    • Quantification absolue
    • Quantification relative - Avec et sans correction d’efficacité (2ddCT)
    • Stratégie de quantification en fonction du contexte biologique
  • Stratégie de normalisation
    • Définition des gènes de référence (housekeeping gene)
    • Choix et validation des gènes de référence : moyenne arithmétique ou géométrique ?
    • Les outils gratuits à connaître (Genorm, Bestkeeper)
  • Les résultats
    • La reproductibilité
    • La sensibilité
    • La précision (exact/relatif)
    • Les réplicats techniques et biologiques
    • Présentation des résultats : nombre de copies, comparatif, fold change, fold increase
    • Quelques logiciels à connaître ou paramétrer Excel ?
  • Publication et PCRQ : les MIQE
  • Validation des microarray et PCRQ haut débit
    • TLDA-Nanostring
  • Différentes approches du génotypage ou polymorphisme en PCRQ
    • Les sondes d’hybridation
    • La PCR digitale
    • Le HRM (High Resolution Melt Analysis)

Dessin des amorces de PCRQ

  • Stratégie efficace de design en 5 étapes faciles :
    • HUGO nomenclature du gène
    • ENSEMBL : connaître son gène pour définir la séquence à amplifier - Organisation intron exon ; séquences codantes,UTR ; isoformes
    • Logiciels et outils de design
      • Beacon designer : pourquoi c’est le meilleur
      • BLAST et MFOLD
      • Les paramètres à spécifier pour les amorces et les amplicons
      • UPL de Roche
      • Les banques d’oligonucléotides
    • Amplify : la PCR électronique très prédictive et gratuite
    • Commande, test et validation des oligos

PCR quantitative : aspect pratique

  • Précautions et risques biologiques
  • Mise en place d’un projet de quantification : les points à considérer
  • Les équipements : thermocycleurs, circuit PCR, Nanodrop, bio analyseur
  • Les consommables
  • Les kits
  • Protocoles et optimisation
  • Échantillons, ARN, cDNA, ADN : nature, qualité, extraction, quantification, conservation
  • La reverse transcription : une étape clé à optimiser en permanence
    • Quantité ARN
    • Le traitement à la Dnase
    • Les différentes enzymes
    • La stratégie d’amorçage et sensibilité détection
    • (oligotDT random primers ou amorce spécifique)
    • Rendement de la RT et vérification
    • Les contrôles de RT
    • Les kits de RT
  • Le cDNA
  • Détecter les inhibitions de la PCR
  • Les amorces
  • La gamme d’étalonnage
  • Les contaminations et cross contaminations

Analyse et exploitation des résultats

  • Programmation des runs
  • Présentation du logiciel du StepOne Plus
  • Analyse des runs – Savoir identifier les erreurs
  • Le piège des (mauvais) algorithmes de détection du seuil
  • Calcul et exploitation des résultats dans Excel
  • Présentation d’outils gratuits pour les calculs ou la normalisation : REST, Bestkeeper
  • Présentation d’outils bio-informatiques pour le design des amorces : HUGO, ENSEMBL, BLAST, UPL, Primer blast, Amplify, etc.
  • Bibliographie
Formateurs

Dr. B. BLANQUIER

Informations complémentaires

Prérequis : AUCUN. Chaque formation donne lieu à l’envoi d’une attestation de fin de formation. En cas d’évaluation des acquis, les résultats sont communiqués. 

Public concerné

Personnels scientifiques et techniques voulant être autonome sur Q-PCR.

Pédagogie

Exercices pratiques et étude de cas. Remise de support de cours. La formation sera sanctionnée par une attestation de formation.

 

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Thi Narin THACH
Chargée de Missions
Tél : 01 41 10 26 22

t.thach@ifis.fr

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Lisa FERNANDEZ
Chargée de Relations Clientèle
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